【生化】Angew：三通道成像揭示活细胞中气体递质对磷酸酶活性的调节作用
酶是一种重要的生命物质，参加体内几乎所有的生物反应，如蛋白质的合成、能量的产生和利用，以及细胞中基因的表达。因此，酶的水平和活性显著影响生物体的生理功能，并与人类各种疾病密切相关。磷酸酶是水解酶家族的重要成员，其通过对蛋白质或其他酶进行脱磷酸化来调节它们的生物学功能。磷酸酶本身的活性受其他上游信号分子如活性氧（ROS）和气体递质控制。在这些信号分子中，硫化氢（H2S）是一种重要的调节剂。因此，探究活细胞中H2S水平和磷酸酶活性的关系显得尤为重要。
近日，安徽大学化学化工学院的张忠平教授课题组基于H2S和磷酸酶敏感的荧光团设计合成了一个一体化识别探针N3-CR-PO4，该探针可同时检测活细胞中的H2S水平和磷酸酶活性。相关成果以“Revealing Gasotransmitter Regulation to Phosphatase Activity in Live Cells by Three-Channel Imaging Correlation”为题发表在Angew. Chem. Int. Ed.上（DOI: 10.1002/anie.201811391）。论文通讯作者为张忠平教授和张瑞龙博士。
作者选用香豆素（发射波长为445 nm）和rhodol（发射波长为545 nm）构建探针，主要考虑因素为：1. 两者的发射峰之间的距离可达100 nm，有效避免了光谱重叠；2. 香豆素的发射光谱与rhodol的吸收光谱重叠，具备荧光能量共振转移（FRET）的条件。N3修饰的香豆素和磷酸修饰的rhodol通过哌嗪环连接，组成了探针N3-CR-PO4。N3具有很强的吸电子效应，抑制香豆素的蓝色荧光；磷酸则抑制rhodol的绿色荧光。一方面，H2S存在时，N3被还原为NH2，探针发出蓝色荧光；另一方面，磷酸酶存在时，磷酸基团被切断从而探针发出绿色荧光；而在H2S和磷酸酶的共存下，由于FRET作用，仅能在香豆素的激发波长下检测到绿色荧光，且该信号比单一的磷酸酶诱导的信号弱（图1a）。
（来源：Angew. Chem. Int. Ed.）
获得了探针N3-CR-PO4之后，作者探究了其对H2S和碱性磷酸酶（ALP）的响应性。首先被研究的是探针对H2S的响应性。在Tris-HCl缓冲液中，探针在360 nm光激发下，445和545 nm处存在两个弱发射峰。随着H2S的加入，探针在445 nm处的发射峰逐渐增强（图1b）。当H2S的浓度为70 μM时，荧光强度达到最大值（增强了13倍）。即使在1 nM H2S的条件下，荧光强度仍增强约1.4倍，表明探针对H2S具有高灵敏性。另外，545 nm处的弱发射峰并没有随着H2S的加入而改变。然后作者研究了探针对ALP的响应性。随着ALP的加入，510 nm光激发下，探针在545 nm处的荧光强度显著增强（图1c）。当ALP浓度为2 U/L时，荧光强度增强了23倍。而在0.01 U/L ALP条件下，荧光强度仍增强了2倍，表明探针对磷酸酶具有极高的敏感性。接着，作者探究了在H2S和ALP共同存在条件下探针的响应情况。在360 nm光激发下，10 μM探针与50 μM H2S的混合溶液在445 nm处表现出蓝色荧光发射。在上述溶液中逐渐加入ALP，445 nm处发射峰的荧光强度迅速下降，而545 nm处的荧光强度显著增强约7倍（图1d）。这些现象均证实了FRET的发生。此外，作者进行了探针选择性实验，发现细胞内常见的分子（氨基酸、肽、蛋白质、酶和无机盐等）对探针的荧光均没有显著的影响（图1e）。
随后，作者用10 μM探针处理HeLa细胞，发现通道CH1（检测H2S）、CH2（检测磷酸酶）和CH3（检测FRET相关性）都表现出强荧光信号（图2a）。为了进一步研究荧光产生的原因，作者用磷酸酶抑制剂（Na3VO4）和H2S生成酶抑制剂（氨氧基乙酸，AOAA）进行了阴性对照实验。当Na3VO4和探针依次与细胞共孵育后，CH2和CH3的荧光信号明显减弱，而CH1的荧光信号增强，作者推测可能是磷酸酶活性受到抑制造成FRET中断而引起的。在另一对照组中，AOAA加入后CH1荧光信号减弱，同时CH2和CH3的荧光信号变得极微弱，与加入Na3VO4时的荧光信号强度大致相当（图2b）。这说明H2S水平降低可能导致活细胞中磷酸酶失活。
（来源：Angew. Chem. Int. Ed.）
为了验证H2S对磷酸酶活性的影响，作者预先用H2S清除剂PMA处理细胞以降低细胞内H2S水平，随后加入10 μM探针共孵育。随着PMA剂量的增加，三个通道的荧光信号逐渐变弱，并且CH2和CH3中的荧光信号几乎消失（图3a和b）。这说明H2S水平降低极大地抑制了磷酸酶的活性，证实了H2S作为活化剂可维持细胞内磷酸酶的正常活性。作者进一步用不同剂量的H2S处理HeLa细胞，然后加入10 μM探针孵育，发现随着H2S的增加，CH1的荧光信号逐渐增强，而CH2和CH3的荧光信号越来越弱（图3c和d）。上述实验结果表明，当H2S水平偏离细胞内正常水平时，磷酸酶活性显著降低。
（来源：Angew. Chem. Int. Ed.）
总而言之，作者设计合成了一个双响应的荧光探针N3-CR-PO4，其在H2S和磷酸酶的作用下分别产生两种可区分的荧光信号。作者结合FRET作用，建立了三通道成像，用于检测活细胞中的H2S水平和磷酸酶活性，并阐明磷酸酶活性与H2S水平的相关性。该探针在探索生物体酶活性调节机制方面具有重要的参考价值。
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